作者

潘莹莹吴凤英

单位

医院肿瘤科

这是1例初次RT-PCR检测ALK阴性，第二次NGS检测出ALK阳性的肺癌患者。

患者信息

患者，男性，33岁，年6月1日因“胸闷气促10天”首次入院，胸片提示右侧大量胸腔积液，胸水为淡血性，未见恶性细胞，胸水引流后胸部CT提示右侧胸膜多发结节影，胸腔镜检查见胸膜菜花样新生物，活检病理免疫组化：Calretin(-),MC(-),E-cad(+),Vim(-),CK7(+),D2-40(+),EMA(-),CK(+),CK5/6(-),WD-1(-),CgA(-),NapsinA(+),TTF-1(+),Syn(-),AE-PAS(+)，提示肺腺癌转移/浸润，明确诊断肺腺癌，基因突变检测提示EGFR（-），ALK(-)，ROS-1(-)，Her-2(-)，RET(-)，Braf(-)，Kras(-)，其中ALK检测方法为RT-PCR。明确诊断后，于.06.12至-09-12行AC（培美曲塞+卡铂）化疗4段，最佳疗效SD，后于.10.25至.03.20行A（培美曲塞）维持治疗5段，年5月因腹胀查胸腹部CT提示肝内新增多发实质性占位，肝脏转移可能，肺内病灶较前增大，疗效评估PD，一线治疗PFS为11个月。

考虑到患者为无吸烟史的年青男性肺腺癌，有驱动基因突变可能性非常大，一线进展后，我们于.5.5行再活检，CT定位下经皮肺穿刺活检提示腺癌细胞。组织标本送检NGS检测，提示ALK融合基因阳性，有2种融合位点：EML4-ALK(E21:A20)，丰度44.6%；LOC-ALK(Lintergenic:A20)基因融合，丰度30.2%。于年5月15日开始克唑替尼mgBid口服，主要不良反应为：纳差，I度，无其他不良反应，口服一个月后复查CT提示肝脏病灶明显缩小，肺病灶较前略有缩小，疗效评价达到PR（如图1）。截至目前为止，患者已口服克唑替尼6个月，持续口服中，疗效持续PR。

图1克唑替尼治疗前后肝脏和肺部CT检查结果

靶向治疗给非小细胞肺癌治疗带来了革命性变化，显著延长了驱动基因阳性患者的生存期，目前在临床中常见的驱动基因有EGFR、K-ras、ALK、ROS-1、Her-2、Braf、RET、MET等，不同的驱动基因突变类型不同，需使用不同的检测方法。对于ALK来说，标准的检测方法是免疫组化、FISH。FISH是目前评估ALK基因重排的“金标准”，并且高度预测对克唑替尼的反应，但FISH检测操作较为复杂，对人员、设备、检测过程、结果判读等要求均较高；免疫组化是对ALK融合蛋白的表达状态进行检测，具有简单快速的优点，但敏感性相对较低，同时也需要考虑到免疫组化的方法存在一定的主观性，对弱阳性结果需要进一步用FISH等技术来验证。医院尝试使用RT-PCR方法检测ALK突变，研究证实用RT-PCR检测出ALK阳性患者一线靶向治疗的PFS不差于标准检测方法检测出的患者，提示RT-PCR是检测ALK驱动基因一个可靠的替代方法。

该患者是个ALK融合基因阳性的肺癌患者，在初诊时活检组织标本对于ALK融合基因使用的RT-PCR检测方法，未检测出ALK基因的融合，在一线化疗失败后，考虑到患者为不吸烟的年轻男性，病理类型为肺腺癌，有驱动基因突变的概率较大，我们给予了再活检，因初诊时活检标本只检测了7种驱动基因的常见突变位点，对于再活检的标本我们采用了更高通量和更高灵敏度的NGS检测方法，发现了ALK基因的融合，融合位点：EML4-ALK(E21:A20)基因融合，丰度44.6%；LOC-ALK(Lintergenic:A20)基因融合，丰度30.2%，说明该患者可能从ALK抑制剂获益。

NGS能同时检测多个基因多种突变类型，不仅是组织标本，还包括血浆ctDNA标本，通过对患者体内与肿瘤靶向治疗、诊断及预后相关分子标记如EGFR、ALK、K-ras、BRAF、HER-2、TP53、RB1等基因进行全面的分析，能更全面了解肿瘤的分子遗传学特征，也能够更精确更全面地为肿瘤的靶向治疗、药效检测和患者的预后评估提供依据。研究发现，肿瘤治疗过程中基因的突变图谱会发生变化，各克隆群体在诊断、治疗后和复发时的变化带来的突变频率的变化在检测结果上就某一项而言，可能并无明显差异，但这种没有差异的表现并不能代表肿瘤内部没有发生克隆群体的改变。所以，NGS在综合所有的相关突变、以基因突变图谱的变化来判断肿瘤的进展、治疗的疗效以及疾病的预后方面拥有明显的优势。

分析两次ALK融合检测结果的差异，可能原因包括检测样本的差异以及检测技术的不同。首先，第一次检测样本主要为肺穿刺组织标本，相比较第二次而言标本量较少，并且第二次还增加了患者的血浆ctDNA标本进行同步检测，提高检测结果的阳性率。FISH、IHC、RT-PCR必须使用组织标本进行检测，NGS能同时用于组织、血浆ctDNA、胸腹水、脑脊液等多种样本类型的检测，对于临床上组织标本较少或无法获得组织标本的患者，使用其它类型的标本进行检测，可以作为组织标本的有效补充。第二，已经证实EML4-ALK融合基因包含多种突变体，多数是由于EML4基因的断裂点不同导致。RT-PCR是在已知EML4-ALK融合转录突变体的基础上，采用三条引物组成的多重RT-PCR技术进行检测，因此RT-PCR只能检测已知的、常见的EML4-ALK融合基因的突变体，对于其它的非EML4基因与ALK融合则不能被检测到。而且EML4第21外显子与ALK融合的转录突变体长度达bp，RT-PCR可能难于检测到。NGS不仅能检测所有已知的、未知的EML4-ALK融合类型，而且可以检测其它融合伴侣与ALK的融合，并能给出具体的融合方式。已知不同EMI4-ALK融合突变体的酪氨酸激酶活性程度有明显差异，因而可能对临床用药具有一定的指导价值。因此相比较RT-PCR而言，NGS测序具有更高的灵敏性和精确性，能检出更多的ALK融合，让更多的患者从ALK抑制剂的治疗中获益。

ALK基因融合发生于约3%-5%的非小细胞肺癌中，多见于非吸烟、较年轻的腺癌患者。其组织学特点以产生粘液为特征，在西方人多为含印戒细胞的实性生长方式，而在亚洲人多以腺泡状生长方式。对于ALK阳性患者，目前获批的药物明显增多，有一代的克唑替尼，二代药物色瑞替尼、Alectinib、Brigatinib，以及三代药物Loratinib。克唑替尼是第一个获批的用于ALK阳性NSCLC的靶向药物，Profile研究结果提示ALK阳性的患者，二线使用克唑替尼相对于二线化疗显著延长PFS（7.7vs3.0个月），Profile和Profile研究告诉我们：对于ALK阳性的肺癌患者，一线使用克唑替尼能带来10.7-11.1个月的PFS获益。新一代的ALK抑制剂在疗效以及对颅内病灶的控制上，超越了第一代药物，在一代药物和二代药物一线头对头比较的临床研究中，第二代药物在PFS得到了显著延长，为患者提供了更多、更佳的选择。该患者为ALK阳性患者，在一线化疗后进展后使用克唑替尼达到了高度PR的疗效，到目前为止患者口服了克唑替尼6个月，疗效为持续PR的状态。

对于不吸烟的年轻男性肺腺癌患者，存在驱动基因突变的概率非常大，在常规检测方法没有发现驱动基因的情况下，尽量使用灵敏度和精确性更高的测序技术如NGS进行检测，可能发现常规方法漏检的驱动基因突变位点。精准诊断是精准治疗的前提，只有明确精准的分子状态后，才能为患者提供最佳的治疗策略。

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