丹参SalviamiltiorrhizaBge.为唇形科鼠尾草属植物，具有活血祛瘀、通经止痛、清心除烦、凉血消痈之功效[1]。丹参作为传统中药中常用药物之一，在我国已有近年的临床应用历史，以丹参为主要原料研制的复方丹参滴丸已成为首例美国FDAIII期临床试验中成药。近年来随着丹参野生资源的减少及社会需求量的增大，人们在寻找新药源的过程中发现丹参地上茎叶作为丹参非传统药用部位，与根具有相似的活性成分及药理作用，其化学成分主要为水溶性的丹酚酸类成分，包括丹参素、原儿茶醛、咖啡酸、迷迭香酸、紫草酸、丹酚酸B、丹酚酸A等[2-4]。研究发现丹参茎叶具有活血化瘀、抗病毒、抗肿瘤、抗氧化、改善糖尿病糖代谢紊乱等药理作用[5-7]。

丹酚酸为一类具有酚羟基或邻二酚羟基的多聚酚酸类化合物，历年来通过对丹参中酚酸类成分的深入研究，证明其在丹参中占有重要的地位。由于其水溶性特点而容易被人体吸收，大多数都具有显著抗氧化活性，可清除超氧阴离子和羟基自由基，抑制脂质过氧化[8]，其抗氧化活性与表现出的多方面药理作用如改善血液循环、抗血栓、抗动脉粥样硬化、促进组织恢复等有着密切关系，是丹参治疗心血管疾病的主要药效物质基础[9-11]。本研究以清除DPPH自由基、ABTS自由基和还原Fe3+能力为药效评价指标，比较7月份和12月份采收的丹参茎叶水提物和醇提物之间的抗氧化活性；同时结合超高效液相色谱-三重四级杆质谱联用技术（UPLC-TQ/MS）对丹参茎叶提取物进行定量分析，并以市售丹参药材作为对照。此外，分析了丹参茎叶提取物中主要丹酚酸类化合物（丹参素、咖啡酸、迷迭香酸和丹酚酸B）的抗氧化活性，比较各提取物及主要丹酚酸类化合物抗氧化活性量效关系特点，为丹参地上茎叶的资源价值发现、资源化利用与产业化开发提供科学依据。

1材料

1.1仪器

WatersACQUITYUPLC系统（包括四元泵溶剂系统、在线脱气机和自动进样器，Waters公司）；Xevo质谱检测器（Waters公司）；MassLynxTM质谱工作站软件（Waters公司）；Enspire多功能酶标仪（美国PerkinElmer公司）；KQ-E型超声波清洗器（昆山禾创超声仪器有限公司）；TDL-B型离心机（上海安亭科学仪器厂）；DHG-9A型电热恒温鼓风干燥箱（上海精宏实验设备有限公司）；EPED超纯水系统（南京易普易达科技发展有限公司）；DSY-高速万能粉碎机（永康市九顺莹商贸有限公司）；ML/02、MS电子天平（上海梅特勒托利多仪器有限公司）。

1.2药品、试剂与药材

对照品原儿茶醛（批号-）、咖啡酸（批号-）、阿魏酸（批号-）、迷迭香酸（批号-）、丹参酮IIA（批号-）、隐丹参酮（批号-）均购自中国食品药品检定研究院质量分数均大于98%；紫草酸（批号MUST-27）、丹酚酸B（批号MUST-）、丹酚酸A（批号MUST-）、丹参素（批号MUST-）、二氢丹参酮I（批号MUST-）、丹参酮I（批号MUST-）均购自北京普天同创生物科技有限公司，质量分数均大于98%；DPPH（1,1-diphenyl-2-picryhydrazyl）、ABTS（2,2′-azinobis-3-ethylbenzothiazolin-6-sulfonicacid）、三吡啶三嗪（TPTZ）、抗坏血酸（Vc）均购自美国Sigma公司；超纯水（实验室自制）；甲酸、乙腈（色谱纯，德国Merck公司）；其他试剂均为分析纯。

丹参茎叶样品分别于年7月和12月采自南京中医药大学药用植物园（江苏南京），经南京中医药大学段金廒教授鉴定为唇形科鼠尾草属植物丹参SalviamiltiorrhizaBge.的干燥茎叶；丹参（根及根茎）样品购于山东长清丹参种植基地，经南京中医药大学段金廒教授鉴定为唇形科鼠尾草属植物丹参SalviamiltiorrhizaBge.的干燥根及根茎。样品于50℃烘干，粉碎过40目筛，常温干燥保存备用。

2方法与结果

2.1供试品溶液的制备

2.1.1水提物的制备分别取7月份采收丹参茎叶（Y-7）、12月份采收丹参茎叶（Y-12）和丹参根及根茎（G）粉末（过40目筛）50g，1∶10加入蒸馏水mL，浸泡过夜，超声提取3次，每次40min，分别离心取上清液，合并上清液。将水提液减压浓缩至生药质量浓度约为1g/mL，缓慢搅拌下加入一定量95%乙醇，使药液乙醇体积分数为80%，4℃冷藏24h，抽滤，滤液减压浓缩，烘干至恒定质量，分别得到7月份采收丹参茎叶水提物（SY-7）、12月份采收丹参茎叶水提物（SY-12）和丹参水提物（SG）。

2.1.2醇提物的制备取水提后的药渣，用80%乙醇加热回流，1∶10提取3次，每次2h，分别滤过，合并滤液，减压浓缩，烘干至恒定质量，分别得7月份采收丹参茎叶醇提物（CY-7）、12月份采收丹参茎叶醇提物（CY-12）和丹参醇提物（CG）。

2.2对照品溶液的制备

取干燥至恒定质量的各对照品适量，精密称定，置10mL量瓶中，以少量90%甲醇溶解，定容至刻度，摇匀，制得丹参素、原儿茶醛、咖啡酸、阿魏酸、迷迭香酸、紫草酸、丹酚酸B、丹酚酸A、二氢丹参酮I、隐丹参酮、丹参酮IIA和丹参酮I质量浓度分别为0.、0.、0.、0.、0.、0.、0.、0.、0.、0.、0.、0.mg/mL的混合对照品溶液作为储备液，其他不同质量浓度的对照品溶液由储备液依次稀释得到。

2.3UPLC-TQ/MS测定

2.3.1色谱条件色谱柱为ACQUITYTMUPLCBEHC18色谱柱（mm×2.1mm，1.7μm）；流动相为0.1%甲酸水（A）-乙腈（B），梯度洗脱：0～6min，97%→70%A；6～7min，70%→60%A；7～10min，60%→5%A；10～12min，5%A；12～13min，5%→97%A；体积流量0.4mL/min，柱温35℃，进样量2μL。

2.3.2质谱条件离子化模式：ESI?/ESI+；检测方式为多反应监测（MRM）；毛细管电压3.0kV；离子源温度℃；脱溶剂气温度℃；脱溶剂气体积流量0L/h；锥孔气体积流量50L/h；碰撞气体积流量0.15mL/min；UPLC-TQ/MS离子流色谱图见图1。

2.3.3方法学考察精密吸取系列混合对照品溶液，按相应UPLC-TQ/MS条件检测，以各成分进样质量浓度为横坐标，峰面积为纵坐标进行线性回归，得回归方程，结果见表1。取混合对照品溶液重复进样6次，以峰面积为指标计算RSD（n＝6），考察方法精密度。取同一份样品溶液分别于0、2、4、8、12、24h进样，以峰面积为指标计算RSD（n＝6），考察样品的稳定性。在已测定各成分质量浓度的样品溶液中加入等量对照品，考察方法的平均回收率（n＝6）。结果表明，各成分精密度RSD≤3.45%，稳定性RSD≤4.34%，平均回收率为95.64%～.85%，均符合分析要求。

2.3.4样品测定分析供试品溶液由上述提取物溶解得到，在相应条件下进行测定，结果见表2。SY-7、SY-12、SG、CY-7、CY-12、CG样品中主要化学组分为8种丹酚酸类成分（丹参素、原儿茶醛、咖啡酸、阿魏酸、迷迭香酸、紫草酸、丹酚酸B和丹酚酸A）及4种丹参酮类成分（二氢丹参酮I、丹参酮I、隐丹参酮和丹参酮IIA）。丹参酮类成分主要存在于丹参醇提物中，丹参茎叶含极其微量脂溶性丹参酮类成分，但富含水溶性丹酚酸类成分，其中SY-7总酚酸量远高于SG中总酚酸的量。在整个生长期至12月份丹参地上茎叶枯萎，所测SY-12和CY-12中各成分的量均明显降低，总酚酸量顺序为SY-7＞CY-7＞SG＞CG＞CY-12＞SY-12。

2.4体外抗氧化活性测定

2.4.1DPPH自由基清除率的测定[12]在96孔板中加入0.25mmol/LDPPH甲醇溶液μL和不同质量浓度受试样品μL，混匀，室温避光反应30min后在nm波长下测定其吸光度（A）值，计算DPPH自由基清除率，通过清除率曲线计算DPPH自由基清除率为50%时的受试样品溶液质量浓度（EC50）。实验重复3次。

DPPH自由基清除率＝1－(A1－A2)/A0

A0为只加DPPH溶液的A值，A1为受试样品加入DPPH反应后的A值，A2为不加DPPH只有受试样品溶液的A值

2.4.2ABTS自由基清除率的测定[13]用去离子水将ABTS和过二硫酸钾（K2S2O8）分别溶解后混合，使其终浓度分别为7.4mmol/L和2.6mmol/L，室温、避光条件下静置12～16h，得到ABTS储备液。测定时用PBS（pH＝7.4）、95%乙醇或甲醇1∶1稀释到nm处A值为0.70±0.02，即得ABTS工作液（现配现用）。反应在96孔板中进行，μLABTS工作液中含有50μL不同质量浓度的受试样品溶液。振荡摇匀后于室温下避光静置6min，nm下测定溶液A值。计算ABTS自由基清除率，通过清除率曲线计算EC50。实验重复3次。

ABTS自由基清除率＝1－(A1－A2)/A0

A0为溶剂与ABTS工作液作用后的A值，A1为受试样品与ABTS工作液作用后的A值，A2为受试样品未加ABTS工作液时的A值

2.4.3还原Fe3+能力测定（FRAP法）FRAP工作液现配现用：mmol/LpH3.6的醋酸盐缓冲液25mL、10mmol/LTPTZ溶液2.5mL、20mmol/LFeCl3溶液2.5mL混合而成。μLFRAP工作液中加入μL不同质量浓度受试样品溶液，振荡均匀，在室温下静置30min，取μL于96孔板，nm处测A值，A值越高，表明还原Fe3+的能力越强[14-15]。样品抗氧化活性以达到同样A值所需的FeSO4的物质的量（mmol）表示，其标准方程为Y＝11.52X－0.，R2＝0.。

2.4.4丹参茎叶提取物抗氧化活性评价通过以清除DPPH自由基、清除ABTS自由基及还原Fe3+能力测定（FRAP法）为指标，以Vc为阳性对照，对6种样品进行抗氧化能力测定，见图2、表3。结果发现，6种丹参提取物对DPPH自由基的清除能力顺序为SY-7＞CY-7＞CG＞SG＞CY-12＞SY-12，清除ABTS自由基能力顺序为SY-7＞CY-7＞SG＞CG＞CY-12＞SY-12，FRAP总抗氧化能力顺序为SY-7＞CY-7＞SG＞CG＞CY-12＞SY-12。结果显示，在3个抗氧化测定指标下，与Vc相比较，丹参6个受试样品均具有不同程度的抗氧化活性，在测定范围内，其抗氧化能力随质量浓度的增大而增强，呈现出明显的量效关系。抗氧化活性强度变化的整体趋势与定量分析中总酚酸质量分数变化趋势相同。

2.4.5丹参素、咖啡酸、迷迭香酸和丹酚酸B抗氧化活性比较

6种提取物成分定量分析结果表明，SY-7、CY-7中丹酚酸类成分的量相对SG和CG较高，且丹参素、咖啡酸、迷迭香酸和丹酚酸B的量最高，在SY-7中分别达到11.、4.、4.、49.mg/g，4种丹参酮类单体化合物在CG中的量较高，但通过预试验发现其抗氧化能力均不显著，因此以4种代表性丹酚酸类单体化合物（丹参素、咖啡酸、迷迭香酸和丹酚酸B）为研究对象进行抗氧化活性研究。

由图3、表4结果可以看出，丹参素、咖啡酸、迷迭香酸和丹酚酸B均具有较强的抗氧化能力，且在一定范围内，抗氧化能力随质量浓度增大而提强，4种丹酚酸类单体化合物对DPPH自由基清除能力的顺序为咖啡酸＞丹参素＞迷迭香酸＞丹酚酸B，对ABTS自由基清除能力的顺序为咖啡酸＞迷迭香酸＞丹参素＞丹酚酸B，FRAP总抗氧化能力顺序为咖啡酸≈迷迭香酸＞丹参素＞丹酚酸B，通过与阳性对照Vc清除DPPH和ABTS自由基的EC50相比较，发现这4种丹酚酸类化合物（丹参素、咖啡酸、迷迭香酸和丹酚酸B）抗氧化能力与Vc相当。

3讨论

近年来国内外研究表明，大多数自由基和活性氧与心血管疾病的发生、发展有着密切关系，因此寻找抗氧化剂及其抗氧化机制的研究尤为重要，而丹参用于治疗心脑血管疾病主要通过抗氧化、清除氧自由基，调节受损机体组织的修复。丹参传统用药部位为丹参根及根茎，本研究以清除DPPH自由基、清除ABTS自由基和铁还原/抗氧化能力（FRAP法）为评价体系，比较7、12月份采收的丹参茎叶水提物及醇提物抗氧化活性，同时对其化学组分进行定性定量分析，结果发现7月份采收的丹参茎叶提取物抗氧化活性最强，且所选取的丹参中主要丹酚酸类单体化合物（丹参素、咖啡酸、迷迭香酸和丹酚酸B）与阳性药Vc相比，皆具有很强的体外抗氧化活性，为天然有效的自由基清除剂。从化学结构来分析，丹酚酸类化合物为酚羟基或邻二酚羟基的供体，是其具有抗氧化活性的基本结构，推测丹酚酸类化合物的抗氧化途径主要是通过提供酚羟基上氢质子，生成半醌式的自由基结构，进而破坏自由基氧化链式反应，清除反应体系中形成的自由基，表现出不同程度的抗氧化活性[16]。

丹参茎叶提取物清除自由基能力强弱与提取物中所含抗氧化成分种类及化合物结构有关外，还与其量密切相关。本课题组前期研究表明，7月份为丹参地上茎叶生长旺盛期，总酚酸的量在此时达到最高[2]，12月份丹参地上茎叶已达枯萎期，各化学组分的量和抗氧化活性均较低。本研究结果显示丹参茎叶水提物和醇提物中主要为丹酚酸类成分，各提取物中丹酚酸的量以SY-7最高，其次为CY，与抗氧化活性呈正相关，这一结果与文献所报道的酚酸类化合物为抗氧化活性主要药效基础相一致[5]。因此，丹参地上茎叶作为丹参非传统药用部位，其富含水溶性丹酚酸类成分，以丹参素、咖啡酸、迷迭香酸和丹酚酸B为主，具有良好的体外抗氧化作用，提示可在不影响丹参药材生长的情况下对适宜生长期的丹参茎叶加以利用，将对丹参资源的综合利用与开发具有重要意义。由于本实验采用体外抗氧化检测体系（多为纯化学反应体系）进行评价，该反应体系中的自由基与生理自由基存在不一致性，检测中自由基损伤的分子种类也与生物体内形成的损伤物质不尽相同。因此，丹参茎叶抗氧化的药效价值尚需进一步在体内外生物体实验中得以验证。

参考文献（略）

来源：曾慧婷，宿树兰，沙秀秀，尚尔鑫，朱振华，郭盛，严辉，钱大玮，段金廒.丹参茎叶提取物抗氧化活性物质基础与量效关系研究[J].中草药,,48(22):-.